​​دستگاه HPLC یک نوع دستگاه کروماتوگرافی مایع می باشدکه به منظور جداسازی نمونه به اجزای مشخص و با فشار مشخص به کار می رود اساس روش HPLC یا همون کروماتوگرافی مایع بر خلاف دستگاه GC جداسازی ها بر مبنای بر هم کنش نمونه با فاز های ساکن و متحرک انجام می شوداز انجایی که ترکیبات مختلفی از فاز ساکن و متحرک برای جداسازی یک مخلوط وجود دارد، انواع گوناگونیدستگاههای کروماتوگرافی وجود دارد که بر مبنای حالت فیزیکی این فازها تقسیم بندی می شود.

انواع دتکتورهای دستگاه کروماتوگرافی مایعHPLC
-دتکتور UV-Vis از رایجترین دتکتورهای ازمایشگاههای آنالیز می باشد.G1314A-G1314B-G1714A
-دتکتور PDA
-دتکتور FLD کاربرد دتکتور فلورسانس انالیز افلاتوکسینها، انالیز مایکوتوکسینها G1721A-G1721B-G1321
-دتکتور ضریب شکست RI انالیز کربوهیدراتها- قندها و شکرها و پلیمرها
-دتکتور طیف سنجی جرمی

​کروماتوگرافی مایع (HPLC)
Refurbished Agilent 1100 Series Hplc Systems

مروری بر تاریخچه کروماتوگرافی

کروماتوگرافی (Chromatography)
یکی از پر‌کاربردترین روش‌های جدا‌سازی مواد کروماتوگرافی یا سوانگاری است. کروماتوگرافی یک واژه یونانی است که از دو کلمه chromaبه معنی رنگ و grophein به معنی نوشتن تشکیل شده است و به طور کلی روشی در علم شیمی است که اجزای یک مخلوط را با عبور دادن یک فاز متحرک از روی یک فاز ساکن جدا می‌کند.
تاریخچه کروماتوگرافی (History Of Chromatography):
اولین بار فردی به نام میخائیل تسوت (Mikhail Tsvet) در سال 1900 میلادی کروماتوگرافی را کشف کرد. ایشان در 14 مه سال 1872 میلادی در آستی ایتالیا به دنیا آمد و در سن 47 سالگی فوت کرد. تسوت از این روش برای جدا‌سازی رنگ‌دانه‌های مختلف مانند کلروفیل‌ها و گزانتوفیل‌ها استفاده می‌کرد.
اساس کار این روش به این صورت است که مخلوط که معمولا به صورت مایع یا گاز است از یک لوله یا شبکه گذرانده می‌شود و با توجه به اینکه سرعت حرکت اجزای تشکیل دهنده مخلوط با توجه به جرم آنها در لوله یا شبکه متفاوت است، مخلوط به اجزای تشکیل‌دهنده تجزیه شده و هر جزء جداگانه خارج می‌شود. این روش وابسته به حرکت نسبی دو فاز است، یکی از فاز‌ها بدون حرکت است و فاز ساکن یا ثابت نامیده می شود و دیگری را فاز متحرک می‌نامند. فاز ساکن در واقع اجزای درون لوله یا شبکه جداسازی را تشکیل می‌دهد و فاز متحرک مربوط به ماده‌ای است که می‌خواهد مورد تجزیه قراربگیرد.
 
انواع روش‌های کروماتوگرافی   
کروماتوگرافی روش‌های متنوعی دارد که بر حسب ماهیت فاز متحرک و ماهیت فاز ثابت دسته‌بندی می‌شود. فاز متحرک ممکن است گاز یا مایع باشد و فاز ثابت جامد یا مایع باشد. به طور کلی به 4 بخش اصلی تقسیم می‌شود. هر بخش نیز انواع مختلفی دارد.
1-کروماتوگرافی مایع – جامد
 جذب ‌سطحی
 لایه‌ی نازک
  تبادل یونی
  ژلی
2-کروماتوگرافی مایع – مایع
 تقسیمی
 کاغذی
3-کروماتوگرافی گاز – مایع
ستون موئین
4-کروماتوگرافی گاز – جامد
انتخاب نوع روش کروماتوگرافی برای جداسازی اجسام عموما بر اساس تجربه می‌باشد زیرا هنوز هیچ راهی برای انتخاب بهترین روش کروماتوگرافی وجود ندارد. در ابتدا از روش‌های ساده‌تری مانند  جذب سطحی و  کاغذی استفاده می‌کنند در صورتی که با استفاده از این روش مستقیما جداسازی انجام نگیرد از روش‌های پیچیده‌تری مانند کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) استفاده می‌شود.
به طورکلی برای جداسازی مواد شیمیایی مشابه از کروماتوگرافی تقسیمی، جداسازی مواد شیمیایی غیر مشابه از کروماتوگرافی جذب سطحی،  جداسازی گاز‌ها و اجسام فرار از کروماتوگرافی گازی، جداسازی مواد زیستی از کروماتوگرافی ژلی و جداسازی مواد یونی از کروماتوگرافی کاغذی یا لایه نازک استفاده می‌شود.
شکل زیر اساس کار کروماتوگرافی گاز – مایع را نشان می دهد.
 
 مزایا 
– در این روش مقدار بسیار کمی از مخلوط برای تجزیه لازم است.کروماتوگرافی می‌تواند در مقیاس میکرو یا نیمه میکرو انجام گیرد.
– ساده و سریع است و وسایل مورد نیاز برای این روش ارزان می‌باشد.
– به دلیل آرام و ملایم بودن این روش احتمال تجزیه مواد جدا شونده نسبت به سایر روش‌ها کمتر است.
–  این روش به نسبت روش تقطیر که جداسازی تقریبا چند روز طول می‌کشد سریع‌تر است و در عرض چند دقیقه تا چند ساعت جداسازی انجام می‌گیرد.
اصطلاحات 
آنالیت: ماده‌ای است که باید در طول فرایند جدا شود و یا به عبارت دیگر چیزی است که باید از مخلوط به دست آید.
کروماتوگرافی آنالیزکننده: برای تشخیص وجود آنالیت و تعیین غلظت آن دریک نمونه استفاده می‌شود.
Elute: فاز متحرکی است که ستون را ترک می‌کند.
Eluent: حلالی است که آنالیت را با خود حمل می‌کند.
کروماتوگراف: وسیله آزمایشگاهی می‌باشدکه امکان جداسازی تخصصی را فراهم می‌کند.
فاز اتصالی: یک فاز ساکن است که با پیوند کووالانسی به درون دیواره‌های ستون کروماتوگراف متصل شده است.
فاز ثابت: ماده تثبیت شده در یک مکان برای عمل کروماتوگرافی
فاز متحرک: فازی است که در یک جهت معین حرکت می‌کند و می‌تواند مایع یا گاز باشد.
نمونه: ماده آنالیز شونده در فرایند می‌باشد که ممکن است از یک ترکیب یا مخلوطی از ترکیبات تشکیل شده باشد.
زمان بازداری: مدت زمان عبور یک آنالیت معین تحت شرایط مشخص​​​​​​​


 اجزاء دستگاه HPLC
همانطور که در شکل ۱ مشاهده می‌کنید دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا شامل اجزاء زیر می‌باشد:
     ۱. مخزن حلال
     ۲. پمپ
     ۳. سیستم تزریق
     ۴. ستون
     ۵. آشکارساز
 
۱. حلال: 
حلال در HPLC باید بسیار خالص بوده که بدین منظور از فیلترهای مخصوصی عبور داده می‌شوند و باید گاززدایی شده باشند تا حباب‌های گاز محلول در آنها، در سیستم آشکارساز اختلال ایجاد نکرده و باعث پهن‌شدگی پیک نشوند. از متداول‌ترین حلال‌ها می‌توان به متانول، استونیتریل و آب اشاره نمود. عبارت شویش در کروماتوگرافی به معنای عبور دادن اجزاء نمونه از میان ستون از طریق افزودن مداوم فاز متحرک می‌باشد که به فاز متحرک اصطلاحا شوینده[۱۲] می‌گویند. دو نوع شویش داریم:
 شویش ایزوکراتیک::در این روش ترکیب فاز متحرک چه از نظر قطبیت و چه از نظر ماهیت در طی فرایند شویش تغییر نمی‌کند. این روش زمانی مناسب است که اجزاء جداشونده دارای قطبیت‌های به اندازه کافی متفاوت از یکدیگر باشند.
 شویش گرادیانی (شیبی):در این روش ترکیب و قطبیت فاز متحرک در فرایند شویش تغییر می‌کند، به عبارتی از چند حلال با نسبت‌های معین که در فرایند شویش قابل تغییر است استفاده می‌شود. این روش زمانی مناسب است که تعداد زیادی اجزاء با دامنه وسیعی از قطبیت وجود داشته باشد.
۲. پمپ HPLC PUMP: 
از مهم‌ترین پمپ‌ها می‌توان به پمپ‌های رفت و برگشتی یا پیستونی اشاره کرد. استفاده از پمپ‌ها به منظور عبور فاز متحرک و نمونه با سرعت و جریان ثابت از میان فاز ساکن می‌باشد.
 
۳. سیستم تزریق INJECTION: 
فشار عملیاتی دستگاه HPLC به اندازه کافی بالا است که نمی‌توان مثل کروماتوگرافی گازی به صورت مستقیم به آن تزریق نمود. بر این اساس تزریق نمونه در Loop صورت می‌گیرد که در شکل۲ مشاهده می‌کنید. با توجه به شکل ابتدا نمونه در Loop که در رنج حجمی ۰/۵ میکرولیتر تا ۵ میلی‌لیتر است و از فاز متحرک (بخش سبز رنگ) جدا می‌باشد، بارگذاری شده (بخش آبی رنگ) و اضافه آن به ضایعات منتقل می‌شود. سپس به حالت تزریق نمونه تغییر داده و در معرض فاز متحرک قرارگرفته و وارد ستون می‌شود. محل تزریق نمونه نیز در شکل ۳-ب آورده شده است که به صورت دستی انجام میگیرد.همچنین  در صورت داشتن تعداد نمونه بالا مخصوصا در بخش‌های تحقیقاتی از سیستم تزریق اتوماتیک (شکل ۳-آ) استفاده میگردد.
۴. ستون: 
روند جداسازی به صورت شماتیک در شکل ۴ آورده شده است. همانطور که مشاهده می‌کنید حلال نمونه کمترین برهمکنش را با فاز ساکن داشته و زودتر از سایر ترکیبات به آشکارساز می‌رسد. ترکیبات دیگر نیز با توجه به میزان برهمکنش آنها با فاز ساکن که در بیشتر موارد بر اساس قطبیت آنها انجام می‌شود، در ستون جداسازی می‌شوند و هر کدام یک نوار (band) را در ستون تشکیل می‌دهند. هر دسته از این ترکیبات پس از خارج شدن از ستون و رسیدن به آشکارساز با یک پیک در کروماتوگرام نشان داده می‌شوند و ماهیت هر پیک با استفاده از زمانی که به آشکارساز می‌رسد مشخص می‌شود. همچنین میزان غلظت هر ترکیب با استفاده از اندازه سطح زیر پیک یا ارتفاع پیک قابل اندازه‌گیری است. گفتنی است زمان بازداری هر نمونه در صورت ثابت بودن تمامی پارامترها در جداسازی، ثابت بوده و با مقایسه آن با نمونه استاندارد،آنالیت مجهول قابل شناسایی و اندازه‌گیری کمی می‌باشد.
 انواع ستون در HPLC:
ستون‌های تجزیه‌ای: این ستون‌ها وظیفه اصلی جداسازی را بر عهده دارند. طول آنها ۱۰-۵۰ سانتی‌متر و قطر داخلی ۴-۱۰ میلی‌متر دارند. جنس آنها فولاد زنگ نزن بوده و قطر ذرات پرکننده در حدود چند میکرومتر است. ذرات پرکننده آن می‌توانند ذرات لایه‌نشانی شده یا مواد متخلخل باشند.
ستون‌های محافظ (گارد): این ستون‌ها تقریبا مشابه ستون‌های تجزیه‌ای بوده اما ذرات پرکننده آنها بسیار درشت‌تر و کوتاهتر می‌باشند. این ستون‌ها قبل از ستون تجزیه‌ای قرار گرفته و نقشی در جداسازی ندارند. به کارگیری آنها به دلایلی همچون حذف ناخالصی از حلال و آنالیت، اشباع کردن فاز متحرک از فاز ساکن و افزایش طول عمر ستون تجزیه ای می‌باشد.
۵. آشکارسازها: 
نمونه بعد از جداسازی در ستون وارد آشکارساز شده و با دریافت هر جزء از اجزای نمونه یک سیگنال الکتریکی تولید می‌کند که پس از فرستاده شدن به یک دستگاه رسام، کروماتوگرام نمونه رسم می‌شود که همچنین شدت هر پیک مربوط به هر ترکیب با مقدار کمی آن جزء متناسب است. از نظر تئوری یک آشکارساز زمانی در شرایط ایده‌آل و بهینه قراردارد که بتواند تمام اجزاء نمونه را به محض خروج از ستون تشخیص داده و متناسب با غلظت هر جزء یک سیگنال تولید کند. پس سرعت پاسخ‌گویی و حساسیت یک آشکارساز مهم‌ترین خصوصیت آن می‌باشد. انواع آشکارسازهای HPLC عبارتند از:
آشکارساز ضریب شکست
آشکارساز UV-Vis
آشکارساز جذب زیرقرمز FTIR
آشکارساز فلورسانی
آشکارسازهای الکتروشیمیایی
آشکارسازهای طیف‌سنج جرمی
آشکارسازهای هدایت‌سنجی
​​​​​​​
نانوفناوری در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا
معرفی نانومواد به عنوان فاز ساکن در کروماتوگرافی مایع به دلیل سطح و خصوصیات ساختاری این دسته از مواد در کنار توانایی آنها در برقراری برهمکنش خاص با آنالیت‌ها، مزایای بیشماری در این زمینه ایجاد کرده است. این جنبه‌ها پیشرفت‌های مهمی را در زمینه کارایی، گزینش پذیری و افزایش رزولوشن و همچنین توسعه بیشتر سیستم‌های کوچک مینیاتوری امکان‌پذیر کرده، که این امر باعث کاهش مصرف حلال و ساده‌سازی پروسه جداسازی شده است.
بر اساس آماده‌سازی فاز ساکن دو دیدگاه وجود دارد. از یک سو بسیاری از محققان توجه خود را به تهیه ستون‌هایی متمرکز کرده‌اند که در آن به دلیل آماده‌سازی هم‌زمان، نفوذپذیری زیاد، شیمی سطح گسترده در دسترس و خاصیت تخلخل خوب؛ نانومواد به ماده دیگری که به عنوان تکیه‌گاه استفاده می‌شود (معمولا ذرات ریز سیلیکا یا پوشش‌های یکپارچه پلیمری)، متصل می‌شوند. از طرفی دیگر، اگرچه کمتر مورد استفاده قرار می‌گیرد؛ نانومواد جزء اصلی فاز ساکن بدون هیچگونه اصلاح سطح بوده و به عنوان پوششی برای اجزاء خاص عمل می‌کنند. در هر دو مورد نوع نانومواد مورد استفاده بسیار متنوع است. بدین منظور، نانو مواد آلی و معدنی یا انواع مواد کربنی مانند نانولوله کربنی، گرافن و فولرین در میان دیگر مواد به دلیل کاربرد مناسب آنها به عنوان فاز ساکن در کروماتوگرافی ارزیابی شدند.
 
کاربرد کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا در آنالیز نانومواد
روش HPLC در آنالیز نانو مواد نیز کاربرد دارد.، برای شناسایی فولرن C60 و  C70 از اتصال (کوپل شدن) HPLC با دیگر روش‌های آنالیز (FT-IR)؛ بر اساس برنامه شویش ایزوکراتیک با ستون غیرقطبی C18 و مخلوط استونیتریل-تولوئن (۱:۱) به عنوان فاز متحرک استفاده شده است. با داشتن زمان خروج نمونه استاندارد و مقایسه آن با زمان خروج نمونه از ستون می‌توان شناسایی کیفی را انجام داد و همچنین با بدست آوردن سطح زیر پیک، غلظت نمونه را می‌توان اندازه گیری کرد (شناسایی کمی).​​​​​​​

جمع‌بندی و نتیجه‌گیری
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) از جمله روش‌های جداسازی پرکاربرد در بسیاری از علوم است. این روش دارای انواع فاز نرمال و فاز معکوس، زوج یون، جذب سطحی، تعویض یونی و طرد اندازه می‌باشد. دستگاه آن شامل بخش‌های مختلف بوده که مهم‌ترین آن ستون بوده که عمل جداسازی در آن اتفاق می‌افتد. فناوری نانو در زمینه انواع فاز ساکن به هدف بهبود گزینش پذیری و کارایی ستون و همچنین در آنالیز نانومواد ورود پیدا کرده است. در این روش با استفاده از زمان بازداری و سطح زیر پیک امکان شناسایی کمی و کیفی مخلوط ترکیبات وجود دارد.​​​​​​​

Agilent 1100 Autosamoler G1329A

Agilent 1100 Autosamoler G1313A

Agilent 1100 Binpump G1312A

 Agilent Technologies-Model1100 (G1312A)Binary Pump
Agilent Technologies-Model1100-Model1100 (G1315A)Quaternary Pump
Agilent Technologies-Model1100-Model1100(1316A) Thermostatted Column compartment
Agilent Technologies-Model1100-Model1100(G1322A/G1379A)Hplc vacum Degasser
​​​​​​​Agilent Technologies-Model1100-Model1100(G1313A)Autosampler​​​​​​​
With Pc & Software​​​​​​​​​​​​​​

Agilent 1100 Iso pump G1310A