​​دستگاه HPLC یک نوع دستگاه کروماتوگرافی مایع می باشدکه به منظور جداسازی نمونه به اجزای مشخص و با فشار مشخص به کار می رود اساس روش HPLC یا همون کروماتوگرافی مایع بر خلاف دستگاه GC جداسازی ها بر مبنای بر هم کنش نمونه با فاز های ساکن و متحرک انجام می شوداز انجایی که ترکیبات مختلفی از فاز ساکن و متحرک برای جداسازی یک مخلوط وجود دارد، انواع گوناگون دستگاههای کروماتوگرافی وجود دارد که بر مبنای حالت فیزیکی این فازها تقسیم بندی می شود.


​نمایندگی فروش دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)
Refurbished Agilent 1100/1200/1260 Series Hplc Systems

کروماتوگرافی چیست؟
کروماتوگرافی (Chromatography)
یکی از پر‌کاربردترین روش‌های جدا‌سازی مواد کروماتوگرافی یا سوانگاری است. کروماتوگرافی یک واژه یونانی است که از دو کلمه chromaبه معنی رنگ و grophein به معنی نوشتن تشکیل شده است و به طور کلی روشی در علم شیمی است که اجزای یک مخلوط را با عبور دادن یک فاز متحرک از روی یک فاز ساکن جدا می‌کند.
تاریخچه کروماتوگرافی (History Of Chromatography)
اولین بار فردی به نام میخائیل تسوت (Mikhail Tsvet) در سال 1900 میلادی کروماتوگرافی را کشف کرد. ایشان در 14 مه سال 1872 میلادی در آستی ایتالیا به دنیا آمد و در سن 47 سالگی فوت کرد. تسوت از این روش برای جدا‌سازی رنگ‌دانه‌های مختلف مانند کلروفیل‌ها و گزانتوفیل‌ها استفاده می‌کرد.
اساس کار روشHPLC به این صورت است که مخلوط که معمولا به صورت مایع یا گاز است از درون ستونHPLC گذرانده می‌شود و با توجه به اینکه سرعت حرکت اجزای تشکیل دهنده مخلوط با توجه به جرم آنها درون ستونhplc متفاوت است، مخلوط به اجزای تشکیل‌دهنده تجزیه شده و هر جزء جداگانه خارج می‌شود. این روش وابسته به حرکت نسبی دو فاز است، یکی از فاز‌ها بدون حرکت است و فاز ساکن یا ثابت نامیده می شود و دیگری را فاز متحرک می‌نامند. فاز ساکن در واقع اجزای درون ستونHPLC جداسازی را تشکیل می‌دهد و فاز متحرک مربوط به ماده‌ای است که می‌خواهد مورد تجزیه قراربگیرد.

انواع روش‌های کروماتوگرافی 
کروماتوگرافی روش‌های متنوعی دارد که بر حسب ماهیت فاز متحرک و ماهیت فاز ثابت دسته‌بندی می‌شود. فاز متحرک ممکن است گاز یا مایع باشد و فاز ثابت جامد یا مایع باشد. به طور کلی به 4 بخش اصلی تقسیم می‌شود. هر بخش نیز انواع مختلفی دارد.
1-کروماتوگرافی مایع – جامد
 جذب ‌سطحی
 لایه‌ی نازک
  تبادل یونی
  ژلی
2-کروماتوگرافی مایع – مایع
 تقسیمی
 کاغذی
3-کروماتوگرافی گاز – مایع
ستون موئین
4-کروماتوگرافی گاز – جامد
انتخاب نوع روش کروماتوگرافی برای جداسازی اجسام عموما بر اساس تجربه می‌باشد زیرا هنوز هیچ راهی برای انتخاب بهترین روش کروماتوگرافی وجود ندارد. در ابتدا از روش‌های ساده‌تری مانند  جذب سطحی و  کاغذی استفاده می‌کنند در صورتی که با استفاده از این روش مستقیما جداسازی انجام نگیرد از روش‌های پیچیده‌تری مانند کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) استفاده می‌شود.
به طورکلی برای جداسازی مواد شیمیایی مشابه از کروماتوگرافی تقسیمی، جداسازی مواد شیمیایی غیر مشابه از کروماتوگرافی جذب سطحی،  جداسازی گاز‌ها و اجسام فرار از کروماتوگرافی گازی، جداسازی مواد زیستی از کروماتوگرافی ژلی و جداسازی مواد یونی از کروماتوگرافی کاغذی یا لایه نازک استفاده می‌شود.
شکل زیر اساس کار کروماتوگرافی گاز – مایع را نشان می دهد.
 
 مزایا 
– در این روش مقدار بسیار کمی از مخلوط برای تجزیه لازم است.کروماتوگرافی می‌تواند در مقیاس میکرو یا نیمه میکرو انجام گیرد.
– ساده و سریع است و وسایل مورد نیاز برای این روش ارزان می‌باشد.
– به دلیل آرام و ملایم بودن این روش احتمال تجزیه مواد جدا شونده نسبت به سایر روش‌ها کمتر است.
–  این روش به نسبت روش تقطیر که جداسازی تقریبا چند روز طول می‌کشد سریع‌تر است و در عرض چند دقیقه تا چند ساعت جداسازی انجام می‌گیرد.
اصطلاحات 
آنالیت:
 ماده‌ای است که باید در طول فرایند جدا شود و یا به عبارت دیگر چیزی است که باید از مخلوط به دست آید.
کروماتوگرافی آنالیزکننده: برای تشخیص وجود آنالیت و تعیین غلظت آن دریک نمونه استفاده می‌شود.
Eluentحلالی است که آنالیت را با خود حمل می‌کند.
فاز اتصالی: یک فاز ساکن است که با پیوند کووالانسی به درون دیواره‌های ستون کروماتوگراف متصل شده است.
فاز ثابت: ماده تثبیت شده در یک مکان برای عمل کروماتوگرافی
فاز متحرک: فازی است که در یک جهت معین حرکت می‌کند و می‌تواند مایع یا گاز باشد.
نمونه: ماده آنالیز شونده در فرایند می‌باشد که ممکن است از یک ترکیب یا مخلوطی از ترکیبات تشکیل شده باشد.
زمان بازداری: مدت زمان عبور یک آنالیت معین تحت شرایط مشخص​​​​​​​


 اجزاء دستگاه HPLC
همانطور که در شکل ۱ مشاهده می‌کنید دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا شامل اجزاء زیر می‌باشد:
     ۱. مخزن حلال
     ۲. پمپ
     ۳. سیستم تزریق
     ۴. ستون
     ۵. آشکارساز
 
۱. حلال: 
حلال در HPLC باید بسیار خالص بوده که بدین منظور از فیلترهای مخصوصی عبور داده می‌شوند و باید گاززدایی شده باشند تا حباب‌های گاز محلول در آنها، در سیستم آشکارساز اختلال ایجاد نکرده و باعث پهن‌شدگی پیک نشوند. از متداول‌ترین حلال‌ها می‌توان به متانول، استونیتریل و آب اشاره نمود. عبارت شویش در کروماتوگرافی به معنای عبور دادن اجزاء نمونه از میان ستون از طریق افزودن مداوم فاز متحرک می‌باشد که به فاز متحرک اصطلاحا شوینده می‌گویند. دو نوع شویش داریم:
شویش ایزوکراتیک:در این روش ترکیب فاز متحرک چه از نظر قطبیت و چه از نظر ماهیت در طی فرایند شویش تغییر نمی‌کند. این روش زمانی مناسب است که اجزاء جداشونده دارای قطبیت‌های به اندازه کافی متفاوت از یکدیگر باشند.
شویش گرادیانی (شیبی):در این روش ترکیب و قطبیت فاز متحرک در فرایند شویش تغییر می‌کند، به عبارتی از چند حلال با نسبت‌های معین که در فرایند شویش قابل تغییر است استفاده می‌شود. این روش زمانی مناسب است که تعداد زیادی اجزاء با دامنه وسیعی از قطبیت وجود داشته باشد.

۲. پمپ HPLC PUMP
از مهم‌ترین پمپ‌ها می‌توان به پمپ‌های رفت و برگشتی یا پیستونی اشاره کرد. استفاده از پمپ‌ها به منظور عبور فاز متحرک و نمونه با سرعت و جریان ثابت از میان فاز ساکن می‌باشد.
 
۳. سیستم تزریق INJECTION 
فشار عملیاتی دستگاه HPLC به اندازه کافی بالا است که نمی‌توان مثل کروماتوگرافی گازی به صورت مستقیم به آن تزریق نمود. بر این اساس تزریق نمونه در Loop صورت می‌گیرد که در شکل۲ مشاهده می‌کنید. با توجه به شکل ابتدا نمونه در Loop که در رنج حجمی ۰/۵ میکرولیتر تا ۵ میلی‌لیتر است و از فاز متحرک (بخش سبز رنگ) جدا می‌باشد، بارگذاری شده (بخش آبی رنگ) و اضافه آن به ضایعات منتقل می‌شود. سپس به حالت تزریق نمونه تغییر داده و در معرض فاز متحرک قرارگرفته و وارد ستون می‌شود. محل تزریق نمونه نیز در شکل ۳-ب آورده شده است که به صورت دستی انجام میگیرد.همچنین  در صورت داشتن تعداد نمونه بالا مخصوصا در بخش‌های تحقیقاتی از سیستم تزریق اتوماتیک (شکل ۳-آ) استفاده میگردد.

۴. ستون 
روند جداسازی به صورت شماتیک در شکل ۴ آورده شده است. همانطور که مشاهده می‌کنید حلال نمونه کمترین برهمکنش را با فاز ساکن داشته و زودتر از سایر ترکیبات به آشکارساز می‌رسد. ترکیبات دیگر نیز با توجه به میزان برهمکنش آنها با فاز ساکن که در بیشتر موارد بر اساس قطبیت آنها انجام می‌شود، در ستون جداسازی می‌شوند و هر کدام یک نوار (band) را در ستون تشکیل می‌دهند. هر دسته از این ترکیبات پس از خارج شدن از ستون و رسیدن به آشکارساز با یک پیک در کروماتوگرام نشان داده می‌شوند و ماهیت هر پیک با استفاده از زمانی که به آشکارساز می‌رسد مشخص می‌شود. همچنین میزان غلظت هر ترکیب با استفاده از اندازه سطح زیر پیک یا ارتفاع پیک قابل اندازه‌گیری است. گفتنی است زمان بازداری هر نمونه در صورت ثابت بودن تمامی پارامترها در جداسازی، ثابت بوده و با مقایسه آن با نمونه استاندارد،آنالیت مجهول قابل شناسایی و اندازه‌گیری کمی می‌باشد.
انواع ستون در HPLC
ستون‌های تجزیه‌ای:
 این ستون‌ها وظیفه اصلی جداسازی را بر عهده دارند. طول آنها ۱۰-۵۰ سانتی‌متر و قطر داخلی ۴-۱۰ میلی‌متر دارند. جنس آنها فولاد زنگ نزن بوده و قطر ذرات پرکننده در حدود چند میکرومتر است. ذرات پرکننده آن می‌توانند ذرات لایه‌نشانی شده یا مواد متخلخل باشند.
ستون‌های محافظ (گارد): این ستون‌ها تقریبا مشابه ستون‌های تجزیه‌ای بوده اما ذرات پرکننده آنها بسیار درشت‌تر و کوتاهتر می‌باشند. این ستون‌ها قبل از ستون تجزیه‌ای قرار گرفته و نقشی در جداسازی ندارند. به کارگیری آنها به دلایلی همچون حذف ناخالصی از حلال و آنالیت، اشباع کردن فاز متحرک از فاز ساکن و افزایش طول عمر ستون تجزیه ای می‌باشد.

۵. آشکارسازها 
نمونه بعد از جداسازی در ستون وارد آشکارساز شده و با دریافت هر جزء از اجزای نمونه یک سیگنال الکتریکی تولید می‌کند که پس از فرستاده شدن به یک دستگاه رسام، کروماتوگرام نمونه رسم می‌شود که همچنین شدت هر پیک مربوط به هر ترکیب با مقدار کمی آن جزء متناسب است. از نظر تئوری یک آشکارساز زمانی در شرایط ایده‌آل و بهینه قراردارد که بتواند تمام اجزاء نمونه را به محض خروج از ستون تشخیص داده و متناسب با غلظت هر جزء یک سیگنال تولید کند. پس سرعت پاسخ‌گویی و حساسیت یک آشکارساز مهم‌ترین خصوصیت آن می‌باشد. انواع آشکارسازهای HPLC عبارتند از:
آشکارساز ضریب شکستRI
آشکارساز UV-Vis
آشکارساز جذب زیرقرمز FT-IR
آشکارساز فلورسانیFLD
آشکارسازهای الکتروشیمیایی
آشکارسازهای طیف‌سنج جرمی
آشکارسازهای هدایت‌سنجی
​​​​​​​
نانو فناوری در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا
معرفی نانومواد به عنوان فاز ساکن در کروماتوگرافی مایع به دلیل سطح و خصوصیات ساختاری این دسته از مواد در کنار توانایی آنها در برقراری برهمکنش خاص با آنالیت‌ها، مزایای بیشماری در این زمینه ایجاد کرده است. این جنبه‌ها پیشرفت‌های مهمی را در زمینه کارایی، گزینش پذیری و افزایش رزولوشن و همچنین توسعه بیشتر سیستم‌های کوچک مینیاتوری امکان‌پذیر کرده، که این امر باعث کاهش مصرف حلال و ساده‌سازی پروسه جداسازی شده است.
بر اساس آماده‌سازی فاز ساکن دو دیدگاه وجود دارد. از یک سو بسیاری از محققان توجه خود را به تهیه ستون‌هایی متمرکز کرده‌اند که در آن به دلیل آماده‌سازی هم‌زمان، نفوذپذیری زیاد، شیمی سطح گسترده در دسترس و خاصیت تخلخل خوب نانومواد به ماده دیگری که به عنوان تکیه‌گاه استفاده می‌شود (معمولا ذرات ریز سیلیکا یا پوشش‌های یکپارچه پلیمری)، متصل می‌شوند. از طرفی دیگر، اگرچه کمتر مورد استفاده قرار می‌گیرد، نانومواد جزء اصلی فاز ساکن بدون هیچگونه اصلاح سطح بوده و به عنوان پوششی برای اجزاء خاص عمل می‌کنند. در هر دو مورد نوع نانومواد مورد استفاده بسیار متنوع است. بدین منظور، نانو مواد آلی و معدنی یا انواع مواد کربنی مانند نانولوله کربنی، گرافن و فولرین در میان دیگر مواد به دلیل کاربرد مناسب آنها به عنوان فاز ساکن در کروماتوگرافی ارزیابی شدند.
 
کاربرد کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا در آنالیز نانومواد
روش HPLC در آنالیز نانو مواد نیز کاربرد دارد.، برای شناسایی فولرن C60 و  C70 از اتصال (کوپل شدن) HPLC با دیگر روش‌های آنالیز (FT-IR)؛ بر اساس برنامه شویش ایزوکراتیک با ستون غیرقطبی C18 و مخلوط استونیتریل-تولوئن  به عنوان فاز متحرک استفاده شده است. با داشتن زمان خروج نمونه استاندارد و مقایسه آن با زمان خروج نمونه از ستون می‌توان شناسایی کیفی را انجام داد و همچنین با بدست آوردن سطح زیر پیک، غلظت نمونه را می‌توان اندازه گیری کرد (شناسایی کمی).​​​​​​

یکی از کاربرد های مهم HPLC سنجش سطح خونی داروها به منظور تعیین سطح مناسب دارویی در بدن بیمار(TDM) است. از دیگر موارد کاربرد HPLC, اندازه گیری آمینواسیدهای خونی است که برای بررسی و تشخیص بیماری های متابولیک از جمله بیماری فنیل کتنوری، هموسیستونوری و غیره به کار می رود.

و از دیگر کاربردهای HPLC در تشخیص پزشگی اندازه گیری مقدار کاتکولامین خون و ادرار می باشد.
​​​​​​​
در مطالعات زیست محیطی از روش HPLC برای آنالیز محتوای آفت کش ها در آب اشامیدنی استفاده می شود.
در صنایع آرایشی از HPLC برای سنجیدن و کنترل کیفی مواد آرایشی گوناگون مانند ماتیک ها، کرم ها، پمادها و... استفاده می شود.

روش HPLC در پزشکی قانونی برای جداسازی فنیل آلکیلامین ها( مورفین و متابولیت های آن) از پلاسمای خون، و برای ردیابی سموم، الکل، کربن منواکسید، بازدارنده های کولین استراز، فلزات سنگین، خواواب آورها و ...مورد استفاده قرار می گیرد.

بهبود روشهای تجزیه و اعتبار سنجی اجزا کلیدی هر برنامه توسعه دارویی هستند. برهمین اساس، روش آنالیز HPLC برای تعیین و مقدار یا خالص سازی ترکیبات موردتوسه فراوانی یافته است.تکنیک HPLC  در مطالعات متنوعی نظیر بررسی پایداری آتروپین، آنتی بیوتیک ها و داروهای متکی بر بیوتکنولوژی نظیر انسولین، استرپتوکیناز و... یک ابزار کلیدی به حساب می آید.

-جداسازی و تعیین هویت داروهای سایکوتروپیک مانند ضد افسردگی ها، بنزودیازپین ها، بوتیروفنون ها، داروهای آرام بخش، فنوتیازین ها و بصورت معمول به روش  HPLC انجام می شود.
 
-تعیین پایداری داروهای مختلف از طریق آنالیزفراورده های تخریبی داروها به روش HPLC قابل انجام است. به عنوان مثال، مطالعات پایداری آتروپین به این روش انجام می پذیرد.
 
-برای تعین زیستی bioassay ترکیباتی نظیرکلرام فنیل، کوتیموکسازول، پنی سیلین ها، هورمون های پپتیدی و سولفونامیدها می توان از HPLC بهره برد.
 
-از HPLC  برای پایش سنتز آلی و نیز برای ایزوله کردن فراورده ها در واکنش می توان بهره برد.
 
-بهره گیری از HPLC یکی از روشهایی است که منجر به کسب ایده ای در مورد خصوصیات بیوفارماسیوتیکال شکل دارویی و فارماسیوتیکال شکل دارویی وفارماکوکینتیک دارو می گردد.

Agilent Technologies-Model1100 (G1312A)Binary Pump
Agilent Technologies-Model1100 (G1315A)Quaternary Pump
Agilent 
Technologies-Model1100 Isocratic (1310A) Pump
Agilent Technologies-Model1100 (1316A) Thermostatted Column compartment
Agilent Technologies-Model1100(G1322A/G1379A)Hplc vacum Degasser
​​​​​​​Agilent Technologies-Model1100(G1313A,G1329A)Autosampler​​​​​​​
​​​​​​

کروماتوگرافی مایع agilent 1100 hplc

​Agilent 1100 HPLC

​Agilent 1200/1260 HPLC

Agilent Technologies-Model1200 (G1312B)Binary Pump
Agilent Technologies-
Model1200 (G1311A)Quaternary Pump
Agilent Technologies-
Model1200 Isocratic (1310A) Pump
Agilent Technologies-
Model1200 (1316A) Thermostatted Column compartment
Agilent Technologies-
Model1200(G1322A/G1379A)Hplc vacum Degasser
​​​​​​​Agilent Technologies-
Model1200(G1376A,G1329A)Autosampler​​​​​​​​​​​​​​

جمع‌بندی و نتیجه‌گیری
​​
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) از جمله روش‌های جداسازی پرکاربرد در بسیاری از علوم است. این روش دارای انواع فاز نرمال و فاز معکوس، زوج یون، جذب سطحی، تعویض یونی و طرد اندازه می‌باشد. دستگاه آن شامل بخش‌های مختلف بوده که مهم‌ترین آن ستون بوده که عمل جداسازی در آن اتفاق می‌افتد. فناوری نانو در زمینه انواع فاز ساکن به هدف بهبود گزینش پذیری و کارایی ستون و همچنین در آنالیز نانومواد ورود پیدا کرده است. در این روش با استفاده از زمان بازداری و سطح زیر پیک امکان شناسایی کمی و کیفی مخلوط ترکیبات وجود دارد.​​​​​​​