اجزاء دستگاه HPLC
همانطور که در شکل ۱ مشاهده میکنید دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا شامل اجزاء زیر میباشد:
۱. مخزن حلال
۲. پمپ
۳. سیستم تزریق
۴. ستون
۵. آشکارساز
۱. حلال:
حلال در HPLC باید بسیار خالص بوده که بدین منظور از فیلترهای مخصوصی عبور داده میشوند و باید گاززدایی شده باشند تا حبابهای گاز محلول در آنها، در سیستم آشکارساز اختلال ایجاد نکرده و باعث پهنشدگی پیک نشوند. از متداولترین حلالها میتوان به متانول، استونیتریل و آب اشاره نمود. عبارت شویش در کروماتوگرافی به معنای عبور دادن اجزاء نمونه از میان ستون از طریق افزودن مداوم فاز متحرک میباشد که به فاز متحرک اصطلاحا شوینده میگویند. دو نوع شویش داریم:
شویش ایزوکراتیک:در این روش ترکیب فاز متحرک چه از نظر قطبیت و چه از نظر ماهیت در طی فرایند شویش تغییر نمیکند. این روش زمانی مناسب است که اجزاء جداشونده دارای قطبیتهای به اندازه کافی متفاوت از یکدیگر باشند.
شویش گرادیانی (شیبی):در این روش ترکیب و قطبیت فاز متحرک در فرایند شویش تغییر میکند، به عبارتی از چند حلال با نسبتهای معین که در فرایند شویش قابل تغییر است استفاده میشود. این روش زمانی مناسب است که تعداد زیادی اجزاء با دامنه وسیعی از قطبیت وجود داشته باشد.
۲. پمپ HPLC PUMP
از مهمترین پمپها میتوان به پمپهای رفت و برگشتی یا پیستونی اشاره کرد. استفاده از پمپها به منظور عبور فاز متحرک و نمونه با سرعت و جریان ثابت از میان فاز ساکن میباشد.
۳. سیستم تزریق INJECTION
فشار عملیاتی دستگاه HPLC به اندازه کافی بالا است که نمیتوان مثل کروماتوگرافی گازی به صورت مستقیم به آن تزریق نمود. بر این اساس تزریق نمونه در Loop صورت میگیرد که در شکل۲ مشاهده میکنید. با توجه به شکل ابتدا نمونه در Loop که در رنج حجمی ۰/۵ میکرولیتر تا ۵ میلیلیتر است و از فاز متحرک (بخش سبز رنگ) جدا میباشد، بارگذاری شده (بخش آبی رنگ) و اضافه آن به ضایعات منتقل میشود. سپس به حالت تزریق نمونه تغییر داده و در معرض فاز متحرک قرارگرفته و وارد ستون میشود. محل تزریق نمونه نیز در شکل ۳-ب آورده شده است که به صورت دستی انجام میگیرد.همچنین در صورت داشتن تعداد نمونه بالا مخصوصا در بخشهای تحقیقاتی از سیستم تزریق اتوماتیک (شکل ۳-آ) استفاده میگردد.
۴. ستون
روند جداسازی به صورت شماتیک در شکل ۴ آورده شده است. همانطور که مشاهده میکنید حلال نمونه کمترین برهمکنش را با فاز ساکن داشته و زودتر از سایر ترکیبات به آشکارساز میرسد. ترکیبات دیگر نیز با توجه به میزان برهمکنش آنها با فاز ساکن که در بیشتر موارد بر اساس قطبیت آنها انجام میشود، در ستون جداسازی میشوند و هر کدام یک نوار (band) را در ستون تشکیل میدهند. هر دسته از این ترکیبات پس از خارج شدن از ستون و رسیدن به آشکارساز با یک پیک در کروماتوگرام نشان داده میشوند و ماهیت هر پیک با استفاده از زمانی که به آشکارساز میرسد مشخص میشود. همچنین میزان غلظت هر ترکیب با استفاده از اندازه سطح زیر پیک یا ارتفاع پیک قابل اندازهگیری است. گفتنی است زمان بازداری هر نمونه در صورت ثابت بودن تمامی پارامترها در جداسازی، ثابت بوده و با مقایسه آن با نمونه استاندارد،آنالیت مجهول قابل شناسایی و اندازهگیری کمی میباشد.
انواع ستون در HPLC
ستونهای تجزیهای: این ستونها وظیفه اصلی جداسازی را بر عهده دارند. طول آنها ۱۰-۵۰ سانتیمتر و قطر داخلی ۴-۱۰ میلیمتر دارند. جنس آنها فولاد زنگ نزن بوده و قطر ذرات پرکننده در حدود چند میکرومتر است. ذرات پرکننده آن میتوانند ذرات لایهنشانی شده یا مواد متخلخل باشند.
ستونهای محافظ (گارد): این ستونها تقریبا مشابه ستونهای تجزیهای بوده اما ذرات پرکننده آنها بسیار درشتتر و کوتاهتر میباشند. این ستونها قبل از ستون تجزیهای قرار گرفته و نقشی در جداسازی ندارند. به کارگیری آنها به دلایلی همچون حذف ناخالصی از حلال و آنالیت، اشباع کردن فاز متحرک از فاز ساکن و افزایش طول عمر ستون تجزیه ای میباشد.
۵. آشکارسازها
نمونه بعد از جداسازی در ستون وارد آشکارساز شده و با دریافت هر جزء از اجزای نمونه یک سیگنال الکتریکی تولید میکند که پس از فرستاده شدن به یک دستگاه رسام، کروماتوگرام نمونه رسم میشود که همچنین شدت هر پیک مربوط به هر ترکیب با مقدار کمی آن جزء متناسب است. از نظر تئوری یک آشکارساز زمانی در شرایط ایدهآل و بهینه قراردارد که بتواند تمام اجزاء نمونه را به محض خروج از ستون تشخیص داده و متناسب با غلظت هر جزء یک سیگنال تولید کند. پس سرعت پاسخگویی و حساسیت یک آشکارساز مهمترین خصوصیت آن میباشد. انواع آشکارسازهای HPLC عبارتند از:
آشکارساز ضریب شکستRI
آشکارساز UV-Vis
آشکارساز جذب زیرقرمز FT-IR
آشکارساز فلورسانیFLD
آشکارسازهای الکتروشیمیایی
آشکارسازهای طیفسنج جرمی
آشکارسازهای هدایتسنجی
نانو فناوری در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا
معرفی نانومواد به عنوان فاز ساکن در کروماتوگرافی مایع به دلیل سطح و خصوصیات ساختاری این دسته از مواد در کنار توانایی آنها در برقراری برهمکنش خاص با آنالیتها، مزایای بیشماری در این زمینه ایجاد کرده است. این جنبهها پیشرفتهای مهمی را در زمینه کارایی، گزینش پذیری و افزایش رزولوشن و همچنین توسعه بیشتر سیستمهای کوچک مینیاتوری امکانپذیر کرده، که این امر باعث کاهش مصرف حلال و سادهسازی پروسه جداسازی شده است.
بر اساس آمادهسازی فاز ساکن دو دیدگاه وجود دارد. از یک سو بسیاری از محققان توجه خود را به تهیه ستونهایی متمرکز کردهاند که در آن به دلیل آمادهسازی همزمان، نفوذپذیری زیاد، شیمی سطح گسترده در دسترس و خاصیت تخلخل خوب نانومواد به ماده دیگری که به عنوان تکیهگاه استفاده میشود (معمولا ذرات ریز سیلیکا یا پوششهای یکپارچه پلیمری)، متصل میشوند. از طرفی دیگر، اگرچه کمتر مورد استفاده قرار میگیرد، نانومواد جزء اصلی فاز ساکن بدون هیچگونه اصلاح سطح بوده و به عنوان پوششی برای اجزاء خاص عمل میکنند. در هر دو مورد نوع نانومواد مورد استفاده بسیار متنوع است. بدین منظور، نانو مواد آلی و معدنی یا انواع مواد کربنی مانند نانولوله کربنی، گرافن و فولرین در میان دیگر مواد به دلیل کاربرد مناسب آنها به عنوان فاز ساکن در کروماتوگرافی ارزیابی شدند.
کاربرد کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا در آنالیز نانومواد
روش HPLC در آنالیز نانو مواد نیز کاربرد دارد.، برای شناسایی فولرن C60 و C70 از اتصال (کوپل شدن) HPLC با دیگر روشهای آنالیز (FT-IR)؛ بر اساس برنامه شویش ایزوکراتیک با ستون غیرقطبی C18 و مخلوط استونیتریل-تولوئن به عنوان فاز متحرک استفاده شده است. با داشتن زمان خروج نمونه استاندارد و مقایسه آن با زمان خروج نمونه از ستون میتوان شناسایی کیفی را انجام داد و همچنین با بدست آوردن سطح زیر پیک، غلظت نمونه را میتوان اندازه گیری کرد (شناسایی کمی).
یکی از کاربرد های مهم HPLC سنجش سطح خونی داروها به منظور تعیین سطح مناسب دارویی در بدن بیمار(TDM) است. از دیگر موارد کاربرد HPLC, اندازه گیری آمینواسیدهای خونی است که برای بررسی و تشخیص بیماری های متابولیک از جمله بیماری فنیل کتنوری، هموسیستونوری و غیره به کار می رود.
و از دیگر کاربردهای HPLC در تشخیص پزشگی اندازه گیری مقدار کاتکولامین خون و ادرار می باشد.
در مطالعات زیست محیطی از روش HPLC برای آنالیز محتوای آفت کش ها در آب اشامیدنی استفاده می شود.
در صنایع آرایشی از HPLC برای سنجیدن و کنترل کیفی مواد آرایشی گوناگون مانند ماتیک ها، کرم ها، پمادها و... استفاده می شود.
روش HPLC در پزشکی قانونی برای جداسازی فنیل آلکیلامین ها( مورفین و متابولیت های آن) از پلاسمای خون، و برای ردیابی سموم، الکل، کربن منواکسید، بازدارنده های کولین استراز، فلزات سنگین، خواواب آورها و ...مورد استفاده قرار می گیرد.
بهبود روشهای تجزیه و اعتبار سنجی اجزا کلیدی هر برنامه توسعه دارویی هستند. برهمین اساس، روش آنالیز HPLC برای تعیین و مقدار یا خالص سازی ترکیبات موردتوسه فراوانی یافته است.تکنیک HPLC در مطالعات متنوعی نظیر بررسی پایداری آتروپین، آنتی بیوتیک ها و داروهای متکی بر بیوتکنولوژی نظیر انسولین، استرپتوکیناز و... یک ابزار کلیدی به حساب می آید.
-جداسازی و تعیین هویت داروهای سایکوتروپیک مانند ضد افسردگی ها، بنزودیازپین ها، بوتیروفنون ها، داروهای آرام بخش، فنوتیازین ها و بصورت معمول به روش HPLC انجام می شود.
-تعیین پایداری داروهای مختلف از طریق آنالیزفراورده های تخریبی داروها به روش HPLC قابل انجام است. به عنوان مثال، مطالعات پایداری آتروپین به این روش انجام می پذیرد.
-برای تعین زیستی bioassay ترکیباتی نظیرکلرام فنیل، کوتیموکسازول، پنی سیلین ها، هورمون های پپتیدی و سولفونامیدها می توان از HPLC بهره برد.
-از HPLC برای پایش سنتز آلی و نیز برای ایزوله کردن فراورده ها در واکنش می توان بهره برد.
-بهره گیری از HPLC یکی از روشهایی است که منجر به کسب ایده ای در مورد خصوصیات بیوفارماسیوتیکال شکل دارویی و فارماسیوتیکال شکل دارویی وفارماکوکینتیک دارو می گردد.