دستگاه کروماتوگرافی مایع HPLC یک نوع دستگاه کروماتوگرافی مایع می باشد که به منظور جداسازی نمونه به اجزای مشخص و با فشار مشخص به کار می رود اساس روش HPLC یا همون کروماتوگرافی مایع بر خلاف دستگاه GC جداسازی ها بر مبنای بر هم کنش نمونه با فاز های ساکن و متحرک انجام می شوداز انجایی که ترکیبات مختلفی از فاز ساکن و متحرک برای جداسازی یک مخلوط وجود دارد، انواع گوناگون دستگاههای کروماتوگرافی وجود دارد که بر مبنای حالت فیزیکی این فازها تقسیم بندی می شود.
کروماتوگرافی (Chromatography) یک روش آزمایشگاهی برای جداسازی اجزای مختلف یک مخلوط است. این روش بر اساس تفاوت در نحوهی حرکت اجزای مخلوط در یک فاز ثابت (مثل کاغذ، ژل یا ستون) و یک فاز متحرک (مثل حلال) عمل میکند. به زبان سادهتر، اجزای مختلف مخلوط با سرعتهای متفاوتی در محیط خاص حرکت میکنند و همین تفاوت باعث جداسازی آنها میشود
انواع رایج کروماتوگرافی
کروماتوگرافی کاغذی (Paper Chromatography): معمولاً برای جداسازی رنگدانهها یا مواد محلول در آب استفاده میشود.
کروماتوگرافی لایه نازک (TLC): مشابه کروماتوگرافی کاغذی ولی با استفاده از یک لایهی نازک از سیلیکا یا آلومینا روی شیشه یا پلاستیک.
کروماتوگرافی ستونی (Column Chromatography): برای جداسازی ترکیبات در مقیاس بزرگتر استفاده میشود، مثلاً در شیمی آلی.
کروماتوگرافی گازی (GC): مخصوص جداسازی ترکیبات فرار؛ در آن فاز متحرک گاز است.
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC): یک روش دقیق و پیشرفته برای جداسازی، شناسایی و اندازهگیری ترکیبات.
دقت و حساسیت بالا: HPLC میتواند مقادیر بسیار کم از یک ماده را با دقت بسیار زیاد تشخیص دهد.
قابلیت جداسازی ترکیبات مشابه: حتی ترکیباتی که ساختار شیمیایی بسیار نزدیکی دارند (مثل ایزومرها) با HPLC قابل جداسازی هستند.
سرعت بالا: با وجود تجهیزات مدرن، آنالیز در زمان کوتاهی انجام میشود.
قابلیت استفاده برای موادغیر فرار و حساس به دما: برخلاف کروماتوگرافی گازی، HPLC برای آنالیز موادی که فرار نیستند یا با گرما تجزیه میشوند، مناسب است.
کاربرد گسترده: در صنایع داروسازی، غذایی، آرایشی، شیمیایی، پزشکی و محیطزیست بهطور گسترده استفاده میشود.
امکان اتصال به دتکتورهای مختلف: مانند UV، فلورسانس و جرمی (MS) که باعث افزایش دقت و اطلاعات بیشتر از نمونه میشود.
مخزن حلال (Solvent Reservoir): محل نگهداری فاز متحرک مانند آب، متانول یا استونیتریل.
پمپ (Pump): انتقال فاز متحرک با فشار بالا به درون سیستم.
دستگاه تزریق نمونه (Injector): ورود نمونه به سیستم؛ میتواند دستی یا خودکار باشد.
ستون کروماتوگرافی (Column): محل جداسازی ترکیبات؛ معمولاً از جنس سیلیکا.
دتکتور (Detector): شناسایی ترکیبات جدا شده. نوع رایج آن UV-Vis است.
سیستم ثبت و تحلیل دادهها (Data System): نرمافزاری برای نمایش و تحلیل کروماتوگرام.
زبالهگیر (Waste): محل خروج مواد پس از تحلیل.
حلالها
در HPLC، حلالها یا فاز متحرک نقش حیاتی دارند، چون ترکیبات مورد نظر در آن حل میشن و از طریق ستون عبور میکنند تا جدا بشوند. انتخاب نوع حلال، درصد ترکیب و ترتیب استفاده از انها تاثیر زیادی روی کیفیت جداسازی دارد.
شفافیت نوری: برای استفاده در دتکتور UV یا فلورسانس، حلال باید در طولموج خاصی جذب نداشته باشد.
سازگاری با ترکیبات نمونه و ستون: حلال باید با ترکیب نمونه و فاز ساکن ستون سازگار باشه تا جداسازی بهینه انجام بشود.
در HPLC فاز معکوس (Reverse Phase) — متداولترین نوع:
آب (Water): اغلب بهعنوان حلال پایه استفاده میشود.
متانول (Methanol): قطبی؛ برای آنالیز بسیاری از ترکیبات مناسب می باشد.
استونیتریل (Acetonitrile): قطبی و نسبتاً قویتر از متانول؛ معمولاً جداسازی سریعتر ایجاد میکند.
بافرها (مثل فسفات یا استات): برای تنظیم pH، مخصوصاً در آنالیز ترکیبات یونی.
در HPLC فاز نرمال (Normal Phase):
هگزان (Hexane)
ایزوپروپانول (Isopropanol)
اتیل استات (Ethyl Acetate)
اینها برای جداسازی ترکیبات غیرقطبیتر استفاده میشوند.
در سیستمهای HPLC شرکت Agilent (مانند سریهای معروف 1100، 1200، 1260 Infinity، و 1290 Infinity II)، انواع مختلفی از پمپها با توجه به نوع آنالیز، دقت، فشار و نیاز به گرادیان طراحی و ارائه میشوند.
۱- پمپ ایزوکراتیک (Isocratic Pump)
مدلها: Agilent G1310A/B (برای سری 1100/1200)
کاربرد: برای آنالیزهایی که فقط از یک نوع فاز متحرک با ترکیب ثابت استفاده میکنند.
مزایا:
ساده و اقتصادی
دقت مناسب برای جداسازیهای ساده
۲- پمپ باینری(Binary Gradient Pump)
مدلها: Agilent G1312A/B (برای سری 1100/1200)، G7112B (برای سری 1290 Infinity II)
ویژگی: ترکیب دو حلال با دقت بالا و قابلیت برنامهریزی گرادیان
کاربرد: برای روشهایی که نیاز به تغییر تدریجی ترکیب حلال در طول زمان دارند (مثلاً آنالیزهای پیچیدهتر)
مزایا:
سرعت و دقت بالا
ایدهآل برای HPLC با فشار بالا (UHPLC در سری 1290)
ویژگی: امکان ترکیب چهار حلال مختلف
کاربرد: مناسب برای توسعه روشها، روشهای پیچیده یا غربالگری حلالها
مزایا:
انعطافپذیری بالا در انتخاب و ترکیب حلال
مناسب برای توسعه روشها
در HPLC، عملکرد injector بسیار حیاتی است زیرا دقت و صحت در تزریق نمونهها میتواند تأثیر زیادی بر نتایج تجزیه و تحلیل داشته باشد. Injector معمولاً به صورت یک سوزن و محفظهای طراحی میشود که میتواند نمونه را بهطور دقیق و با حجم ثابت وارد جریان مایع کند. از انواع رایج آن میتوان به injectorهای دستی و اتوماتیک اشاره کرد که بسته به کاربرد، نوع نمونه و حساسیت مورد نیاز متفاوت هستند.
مراحل عملکرد اینجکتور:
بارگذاری نمونه (Load): نمونه توسط سرنگ یا اتوسمپلر به داخل لوپ تزریق وارد میشود، در حالی که فاز متحرک هنوز از داخل لوپ عبور نمیکند.
تزریق نمونه (Inject): مسیر شیر تغییر کرده و فاز متحرک از داخل لوپ عبور میکند و نمونه را به ستون هدایت میکند.
تکرارپذیری: حجم لوپ دقیق است و باعث میشود تزریقها قابل تکرار و با دقت بالا انجام شوند.
ساختار کلی ستون HPLC: ستون HPLC بخش اصلی و کلیدی در جداسازی مواد است. این ستون معمولاً از فولاد ضدزنگ ساخته شده و درون آن با ذراتی از مواد مختلف (معمولاً سیلیکا یا مشتقات آن) پر شده است.
پارامترهای مهم ستون عبارتاند از:
طول ستون: از 3 تا 30 سانتیمتر
قطر داخلی: 1 تا 10 میلیمتر
اندازه ذرات: معمولاً 3 تا 5 میکرومتر
۱- ستون فاز معکوس (Reverse Phase – RP)
فاز ساکن: غیرقطبی (مانند C18 یا C8)
۲- ستون فاز نرمال (Normal Phase – NP)
۳- ستون یون-تبادلی (Ion Exchange Columns)
۴- ستون بر اساس اندازه (Size Exclusion)
۵- ستون هیدروفیلیک HILIC (Hydrophilic Interaction LC)
در دستگاه HPLC نقش حیاتی در شناسایی و اندازهگیری ترکیبات جدا شده توسط ستون دارد. بهعبارت ساده، دتکتور چیزی است که به ما میگوید هر ترکیب چه زمانی از ستون خارج شده و چه مقدار از آن وجود دارد.
۱- تشخیص ترکیبات: وقتی ترکیبات جدا شده از ستون خارج میشوند، وارد دتکتور میشوند. دتکتور تغییراتی (مثلاً جذب نور، تغییر ضریب شکست، هدایت الکتریکی و…) را ثبت میکند که نشاندهنده حضور یک ماده خاص است.
۲- تبدیل سیگنال به داده: دتکتور این تغییرات را به سیگنال الکتریکی تبدیل میکند که بعداً توسط نرمافزار به نمودار (کروماتوگرام) تبدیل میشود.
۳- اندازهگیری کمّی: با مقایسه ارتفاع یا سطح پیکها در کروماتوگرام، میتوان مقدار هر ترکیب را محاسبه کرد.
دتکتورهای HPLC از اجزای حیاتی دستگاه هستند که در شناسایی و آنالیز ترکیبات جداشده از ستون کروماتوگرافی استفاده میشوند. شرکت Agilent یکی از برترین تولیدکنندگان دتکتورهای HPLC است و دتکتورهای متنوعی برای نیازهای مختلف آنالیز شیمیایی دارد. در اینجا چند نوع دتکتور رایج Agilent HPLC رو معرفی میکنم:
• مدلهای محبوب: Agilent 1200 Series UV-Vis, Agilent 1260 Infinity UV-Vis
• ویژگیها: این دتکتورها برای اندازهگیری جذب نور در نواحی UV و VIS (اشعه ماوراء بنفش و مرئی) طراحی شدهاند.
این دتکتورها بیشتر برای ترکیباتی که خاصیت جذب UV دارند، مثل داروها یا ترکیبات آلی، مناسب هستند.
• کاربردها: آنالیز داروها، پلیمرها، مواد شیمیایی آلی و غیره.
• مدلهای محبوب: Agilent 1200 Series Fluorescence Detector
• ویژگیها: این دتکتورها بهطور خاص برای شناسایی ترکیباتی که خاصیت فلورسانس دارند استفاده میشوند.
حساسیت بالا و انتخابپذیری خوبی دارند.
• کاربردها: شناسایی ترکیبات زیستی، داروها، رنگها، مواد شیمیایی که فلورسانس دارند.
• ویژگیها: این دتکتورها تغییرات در شاخص انکسار نور را اندازهگیری میکنند. این دتکتورها برای ترکیباتی که جذب UV ندارند، مفید هستند.
• کاربردها: آنالیز ترکیباتی مانند قندها، الکلها و پلیمرهای بدون گروههای کروماتوگرافی فعال (مثل پلیاتیلن گلیکول).
• مدلهای محبوب: Agilent 1260 Infinity ELSD
• ویژگیها: این دتکتور برای ترکیباتی که قابل جذب نور یا فلورسانس نیستند، بسیار مفید است.
اساس کار آن تبخیر حلال از نمونه و اندازهگیری پراکندگی نور از ذرات است.
• کاربردها: آنالیز پلیمرها، چربیها، و ترکیباتی که خاصیت نوری ندارند.
۵- دتکتور MS (Spectrometer Mass)
• مدلهای محبوب: Agilent 6495C Triple Quadrupole LC/MS
• ویژگیها: این دتکتور ترکیب HPLC را با اسپکتروفتومتری جرم (Mass Spectrometry) ترکیب میکند
و اطلاعات دقیقی از جرم مولکولی و ساختار ترکیبات فراهم میکند.
• کاربردها: آنالیز دقیق داروها، ترکیبات پیچیده زیستی، و شناسایی و کمیتیابی ترکیبات پیچیده در نمونههای بیولوژیکی.
• مدلهای محبوب: Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector
• ویژگیها: دتکتور DAD به شما این امکان را میدهد که در چند طول موج مختلف بهطور همزمان اندازهگیری کنید.
این دتکتور برای ترکیباتی که در چند ناحیه از طیف UV و VIS جذب دارند، مناسب است.
• کاربردها: شناسایی دقیق ترکیبات دارویی، مواد غذایی، آب و محیط زیست
۱- صنعت داروسازی
• کنترل کیفیت داروها
• تعیین مقدار مواد مؤثره (API)
• بررسی پایداری دارو و محصولات تجزیهشده
• مطالعات فارماکوکینتیک (جذب، متابولیسم، دفع دارو)
• آنالیز فرمولاسیونهای نانویی
۵- صنعت پتروشیمی و نفت
• جداسازی و شناسایی ترکیبات آلی پیچیده
• بررسی افزودنیها و ناخالصیها در محصولات نفتی
۶- صنایع بیوتکنولوژی
• آنالیز پروتئینها، پپتیدها، آنزیمها
• کنترل کیفیت فرآوردههای زیستی (مثل واکسنها، آنتیبادیها)
۷- صنعت آب و فاضلاب
• اندازهگیری آلودگیهای آلی
• بررسی غلظت داروها یا ترکیبات شیمیایی در آب آشامیدنی و پسابها
۸- تحقیقات علمی و دانشگاهی
• کاربرد گسترده در پروژههای تحقیقاتی شیمی، بیوشیمی، داروسازی، زیستفناوری و پزشکی
• توسعه روشهای نوین جداسازی و آنالیز
۱-فیلترها (Filters)
ب) فیلتر انتهایی ستون (Column End Filter)
انواع: C18، C8، فاز معکوس (Reverse Phase)، فاز نرمال (Normal Phase)، HILIC و غیره.
نکته: ستونها بسته به نوع آنالیز و ترکیب هدف انتخاب میشوند و عمر مفید آنها به شرایط کاری بستگی دارد.
۳- سپتوم و درپوش مخزن (Septum & Cap)
۹- قطعات یدکی پمپ (Pump Spare Parts)
لوازم مصرفی HPLC نقش کلیدی در تضمین کیفیت آنالیزها و عملکرد طولانیمدت دستگاه دارند. استفاده از لوازم مصرفی مرغوب، تعویض بهموقع و نگهداری صحیح از آنها میتواند باعث افزایش دقت نتایج، کاهش خطاها و جلوگیری از خرابیهای پرهزینه شود
جمعبندی و نتیجهگیری
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) از جمله روشهای جداسازی پرکاربرد در بسیاری از علوم است. این روش دارای انواع فاز نرمال و فاز معکوس، زوج یون، جذب سطحی، تعویض یونی و طرد اندازه میباشد. دستگاه HPLC آن شامل بخشهای مختلف بوده که مهمترین آن ستون بوده که عمل جداسازی در آن اتفاق میافتد. فناوری نانو در زمینه انواع فاز ساکن به هدف بهبود گزینش پذیری و کارایی ستون و همچنین در آنالیز نانومواد ورود پیدا کرده است. در این روش با استفاده از زمان بازداری و سطح زیر پیک امکان شناسایی کمی و کیفی مخلوط ترکیبات وجود دارد.